Valkudest ning nende struktuurist ja funktsioonist lähtuvalt on tänapäeva bioloogia arengu peamiseks suunaks kujunenud elunähtuste mõistmine molekulaarsel tasandil. Valkude uurimiseks peame esmalt hankima kõrgelt puhastatud ja bioloogiliselt aktiivseid sihtaineid. Valkude valmistamine hõlmab erinevaid füüsika, keemia ja bioloogia aspekte, kuid põhiprintsiibid ei ole muud kui kaks aspekti. Üks on kasutada segu mitme komponendi jaotuskiiruste erinevusi, et jaotada need kahte või mitmesse faasi, mida saab eraldada mehaaniliste meetoditega, nagu väljasoolamine, orgaanilise lahustiga ekstraheerimine, kromatograafia ja kristallimine jne; teine on Segu asetatakse ühte faasi ja komponendid jaotatakse samale alale füüsikaliste jõuväljade toimel, et saavutada eraldamise eesmärgid, nagu elektroforees, ultratsentrifuugimine, ultrafiltreerimine jne. Kõigi nende rakendamisel meetodite puhul tuleb hoolitseda selle eest, et säiliks bioloogiliste makromolekulide terviklikkus ja välditaks kavandatavate ainete bioloogilise aktiivsuse kadumist hapete, leeliste, kõrgete temperatuuride ja tugevate mehaaniliste mõjude tõttu. Valkude valmistamine jaguneb üldiselt neljaks järgmiseks etapiks: materjali valik ja eeltöötlus, rakkude lõhkumine ja organellide eraldamine, ekstraheerimine ja puhastamine, kontsentreerimine, kuivatamine ja säilitamine. Valkude valmistamisel saab toorainena kasutada mikroorganisme, taimi ja loomi ning materjalid valitakse peamiselt eksperimendi eesmärgist lähtuvalt. Mikroorganismide puhul tuleks tähelepanu pöörata nende kasvufaasile. Mikroorganismide logaritmilises kasvufaasis on ensüümide ja nukleiinhapete sisaldus kõrge ning võimalik saada suuri saake. Mikroorganismide kasutamisel materjalidena on kaks olukorda: (1) Mikroobirakkude sekretsiooni tuleb kasutada Kultuurikeskkonnas olevad metaboliidid ja rakuvälised ensüümid; (2) Kasutage bakterites sisalduvaid biokeemilisi aineid, nagu valgud, nukleiinhapped ja rakusisesed ensüümid. Taimsed materjalid tuleb koorida ja rasvatustada ning tähelepanu tuleks pöörata erinevatele taimesortidele ning kasvu- ja arengutingimustele. Neis sisalduvate bioloogiliste makromolekulide hulk on väga erinev ja on tihedalt seotud hooajalisusega. Loomsete kudede puhul tuleb tooraineks valida toimeainerikkad elundikuded, mis tuleb esmalt hakkida ja rasvatustada. Lisaks tuleks eeltöödeldud materjalid külmutada ja ladustada, kui neid kohe katseteks ei kasutata, ning värsketest materjalidest kergesti lagunevate biomakromolekulide valmistamiseks. Valkude eraldamine ja puhastamine 1. Valkude (sh ensüümide) ekstraheerimine Enamik valke lahustuvad vees, lahjendatud soolas, lahjendatud happe- või leeliselahustes, samas kui väike hulk lipiididega seotud valke lahustub orgaanilistes lahustites nagu etanool, atsetoon, butanool ja nii edasi. Seetõttu saab valkude ja ensüümide ekstraheerimiseks, eraldamiseks ja puhastamiseks kasutada erinevaid lahusteid. (1) Vesilahusega ekstraheerimise meetod. Lahjendatud soola ja puhversüsteemi vesilahusel on hea stabiilsus ja valkude kõrge lahustuvus. See on valkude ekstraheerimiseks kõige sagedamini kasutatav lahusti. Tavaline annus on 1-5 korda suurem kui tooraine maht. Ekstraheerimise ajal on vaja ühtlast segamist, et hõlbustada valkude lahustumist. Ekstraheerimistemperatuur sõltub toimeainete omadustest. Ühest küljest suureneb enamiku valkude lahustuvus temperatuuri tõustes. Seetõttu soodustab kõrge temperatuur lahustumist ja lühendab ekstraheerimisaega. Kuid teisest küljest denatureerib ja inaktiveerib temperatuuri tõus valke. Seetõttu kasutatakse selle kaalutluse põhjal valkude ja ensüümide ekstraheerimisel üldiselt madala temperatuuriga (alla 5 kraadi) toiminguid. Et vältida lagunemist valgu ekstraheerimisel, võib lisada proteolüütiliste ensüümide inhibiitoreid (nagu diisopropüülfluorofosfaat, jodoäädikhape jne).
Kontsentreerimine, kuivatamine ja säilitamine 1. Proovide kontsentreerimine Bioloogiliste makromolekulide ettevalmistamise käigus muutuvad proovid kolonnpuhastuse tõttu väga lahjemaks. Säilitamiseks ja identifitseerimiseks on sageli vaja kontsentratsiooni. Tavaliselt kasutatavad kontsentreerimismeetodid: 1. Dekompressiooni ja kuumutamise aurustamise kontsentratsioon alandab vedeliku keemistemperatuuri, vähendades vedeliku pinnarõhku. Mida kõrgem on dekompressiooni vaakumaste, seda madalamale langeb vedeliku keemistemperatuur ja seda kiiremini see aurustub. See meetod sobib mõnele patsiendile, kes ei talu kuumade bioloogiliste makromolekulide kontsentratsiooni. 2. Õhuvool aurustub ja kontsentreerub. Õhuvool võib kiirendada vedeliku aurustumist ja jaotada lahuse õhukese kihina, kusjuures õhuvool läbib pidevalt pinda; või asetage bioloogilise makromolekuli lahus dialüüsikotti ja asetage see külma ruumi ning puhuge õhku ventilaatoriga. Membraani läbiv lahusti ei aurustu, et saavutada kontsentreerimise eesmärki. Sellel meetodil on aeglane kontsentreerimiskiirus ja see ei sobi suure koguse lahuse kontsentreerimiseks. 3. Külmutamismeetod: bioloogilised makromolekulid külmuvad madalal temperatuuril jääks. Soolad ja bioloogilised makromolekulid ei sisene jäässe, vaid jäävad vedelasse faasi. Töötamise ajal jahutatakse kontsentreeritav lahus kõigepealt tahkeks aineks ja seejärel sulatatakse aeglaselt. Lahusti ja lahustunud aine sulamistemperatuuride erinevust kasutatakse suurema osa lahustist eemaldamise eesmärgi saavutamiseks. Näiteks kui selle meetodiga kontsentreeritakse valgu ja ensüümi soolalahus, hõljuvad puhtad jääkristallid ilma valgu ja ensüümita vedeliku pinnal ning valk ja ensüüm kontsentreeritakse alumisse lahusesse. Eemaldades ülemised jääkuubikud, saab valgu ja ensüümi kontsentratsiooni. vedel. 4. Absorptsioonimeetod: lahuses olevad lahuse molekulid kogutakse otse läbi absorbendi, et see kontsentreerida. Kasutatav absorbent ei tohi lahusega keemiliselt reageerida, ei tohi adsorbeerida bioloogilisi makromolekule ja olla lahusest kergesti eraldatav. Tavaliselt kasutatavad absorbendid hõlmavad polüetüleenglükooli, polüvinüülpürrolidooni, sahharoosi ja geeli. Polüetüleenglükooli absorbeerijate kasutamisel pange esmalt bioloogilise makromolekuli lahus poolläbilaskvasse membraankotti ja lisage polüetüleenglükool. Kui katta alkoholiga ja asetada 4 kraadi Celsiuse juurde, imendub kotist välja imbunud lahusti kiiresti polüetüleenglükooli. Pärast polüetüleenglükooli küllastumist veega tuleb see asendada uuega, kuni saavutatakse vajalik maht. 5. Ultrafiltreerimine Ultrafiltreerimine on meetod, mis kasutab spetsiaalset membraani erinevate lahustunud aine molekulide selektiivseks filtreerimiseks. Kui vedelik läbib membraani teatud rõhu all (lämmastiku rõhk või vaakumpumba rõhk), blokeeritakse ja säilitatakse lahusti ja väikesed molekulid. See on viimastel aastatel välja töötatud uus meetod. See sobib kõige paremini bioloogiliste makromolekulide, eriti valkude ja ensüümide kontsentreerimiseks või magestamiseks. Sellel on madal hind, lihtne töö, kerged tingimused ja seda saab paremini hooldada. Sellel on bioloogiliste makromolekulide kõrge aktiivsus ja kõrge taastumiskiirus. Ultrafiltratsiooni rakendamise võti on membraanide valik. Erinevatel membraanide tüüpidel ja spetsifikatsioonidel on erinevad parameetrid, nagu vee voolukiirus ja molekulmassi piirväärtus (st molekulide minimaalne molekulmassi väärtus, mida membraan suudab säilitada), ning need tuleb valida vastavalt töövajadustele. Lisaks mõjutavad ultrafiltrimise efekti teatud määral ultrafiltreerimisseadme vorm, lahustunud aine koostis ja omadused, lahuse kontsentratsioon jne. Õõneskiudtorud on valmistatud ultrafiltreerimismembraanidest ja paljud sellised torud on koondatud kimpu. Torude mõlemad otsad on ühendatud madala ioontugevusega puhvriga, nii et puhver voolab torus pidevalt. Seejärel sukeldatakse kiudtoru dialüüsitavasse valgulahusesse. Kui puhver voolab läbi kiudtoru, võivad väikesed molekulid kergesti difundeeruda läbi membraani, kuid suured molekulid mitte. See on kiudfiltratsiooni dialüüsi meetod. Suurenenud dialüüsipiirkonna tõttu lüheneb dialüüsiaeg 10 korda. 2. Kuivatamine: riknemise vältimiseks ja säilitamise hõlbustamiseks tuleb bioloogilistest makromolekulidest valmistatud tooteid sageli kuivatada. Kõige sagedamini kasutatavad meetodid on külmkuivatamine ja vaakumkuivatus. Vaakumkuivatus sobib ainete kuivatamiseks ja säilitamiseks, mis ei talu kõrgeid temperatuure ja on oksüdatsioonile kalduvad. Lisaks kuivati, kondensaatori ja vaakumkuivatuspõhimõttele lisab kogu seade ka temperatuuriteguri. Sama rõhu all väheneb veeauru rõhk temperatuuri langedes, mistõttu madalal temperatuuril ja madalal rõhul sublimeerub jää kergesti gaasiks. Töötamise ajal külmutatakse kuivatatav vedelik tavaliselt esmalt alla külmumistemperatuuri, et muuta see tahkeks, seejärel muudetakse lahusti madalal temperatuuril ja madalal rõhul gaasiks ning eemaldatakse. Selle meetodiga kuivatatud toodete eelisteks on lõtvus, hea lahustuvus ja loomuliku struktuuri säilimine ning need sobivad erinevate bioloogiliste makromolekulide kuivatamiseks ja säilitamiseks. 3. Säilitamine Bioloogiliste makromolekulide stabiilsus on tihedalt seotud säilitamismeetodiga. Kuivtooted on üldiselt suhteliselt stabiilsed ja nende aktiivsus võib madalatel temperatuuridel püsida muutumatuna päevi või isegi aastaid. Säilitusnõuded on lihtsad, kui kuivatatud proovid asetatakse eksikaatorisse (sisaldab kuivatusainet) ja suletakse ning hoitakse temperatuuril 0-4 Vedelike säilitamisel tuleb arvestada järgmiste punktidega: 1. Proov ei tohi olla liiga suur. lahjendada. Enne pakkimist ja ladustamist tuleb see kontsentreerida teatud kontsentratsioonini. Liiga lahjendatud proov võib kergesti denatureerida bioloogilisi makromolekule. 2. Üldiselt tuleb lisada säilitusaineid ja stabilisaatoreid. Tavaliselt kasutatavad säilitusained hõlmavad tolueeni, bensoehapet, kloroformi, tümooli jne. Tavaliselt kasutatavate valkude ja ensüümide stabilisaatorite hulka kuuluvad ammooniumsulfaatpasta, sahharoos, glütserool jne. Ensüümidele võib nende stabiilsuse parandamiseks lisada ka substraate ja koensüüme. Lisaks on sellistel lahustel nagu kaltsium, tsink ja boorhape teatud ensüümide suhtes ka teatud kaitsev toime. Nukleiinhappe makromolekule säilitatakse tavaliselt naatriumkloriidi või naatriumtsitraadi standardpuhverlahustes. 3. Säilitustemperatuuri nõuded on madalad, enamikku hoitakse külmkapis umbes 0 kraadi juures ja mõned nõuavad madalamat temperatuuri, olenevalt erinevatest ainetest.